El aumento de peso corporal en ratones con mutación del gen de la ribonucleoproteína 1 mensajera X frágil (Fmr1) se asocia con disfunción hipotalámica

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12666 (2023) Citar este artículo

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Las mutaciones en el gen de la ribonucleoproteína 1 mensajera del X frágil (FMR1) están relacionadas con el síndrome del X frágil, la causa monogénica más común de discapacidad intelectual y autismo. Las personas afectadas con mutaciones en FMR1 tienen una mayor incidencia de obesidad, pero los mecanismos se desconocen en gran medida. En el estudio actual, determinamos que los ratones knockout para Fmr1 macho (KO, Fmr1-/y), pero no las hembras Fmr1-/-, exhiben un mayor peso en comparación con los controles de tipo salvaje, de manera similar a los humanos con mutaciones en FMR1. No se encontraron diferencias en la ingesta de alimentos o agua entre los grupos; sin embargo, los machos Fmr1−/y muestran una menor actividad locomotora, especialmente durante su fase activa. Además, Fmr1-/y tiene disfunción olfativa determinada mediante la prueba de comida enterrada, aunque exhiben un mayor comportamiento compulsivo, determinado mediante la prueba de enterramiento de mármol. Dado que las regiones olfativas del cerebro se comunican con las regiones hipotalámicas que regulan la ingesta de alimentos, incluidas las neuronas POMC que también regulan la locomoción, examinamos la inervación y el número de neuronas POMC en ratones Fmr1-/y. Las neuronas POMC expresan Fmrp, y las neuronas POMC en Fmr1−/y tienen entradas sinápticas GABAérgicas inhibidoras más altas. De acuerdo con una mayor inervación inhibidora, las neuronas POMC en los ratones Fmr1-/y exhiben una menor actividad, según la expresión de cFOS. En particular, los ratones Fmr1-/y tienen menos neuronas POMC que los controles, específicamente en el núcleo arqueado rostral, lo que podría contribuir a una disminución de la locomoción y un aumento del peso corporal. Estos resultados sugieren un papel de Fmr1 en la regulación de la función de las neuronas POMC y la etiología de la obesidad relacionada con Fmr1.

Las mutaciones en el gen de la ribonucleoproteína 1 mensajera del X frágil (FMR1) causan el síndrome del X frágil (FXS), la forma genética más común de discapacidad intelectual1,2. Las personas afectadas por este trastorno presentan deterioro mental, autismo y mayor incidencia de obesidad3,4,5,6,7. La mutación implica la expansión de las repeticiones inestables del trinucleótido CGG, lo que conduce a la hipermetilación, el silenciamiento del gen y la pérdida del producto proteico, FMRP. FMRP es una proteína de unión a ARNm que regula los niveles de proteína de sus objetivos8,9. En el cerebro, donde se expresa más, la FMRP se une a los ARNm que codifican proteínas sinápticas, lo que contribuye a las disfunciones cognitivas en el FXS10,11,12. Si bien están comenzando a surgir los mecanismos del deterioro intelectual tras la pérdida del FMRP, se desconocen los mecanismos del aumento de peso. Se ha analizado el efecto de la pérdida de FMRP en la corteza y el hipocampo13,14; sin embargo, no se ha examinado cómo las mutaciones afectan las funciones hipotalámicas. En este documento, investigamos los efectos de la pérdida de FMRP en la regulación del peso corporal y la ingesta de alimentos, utilizando el modelo de ratón knock-out para Fmr1 (Fmr1-/y, KO). Debido a la metilación diferencial entre genes humanos y de ratón, Fmr1 KO es un modelo de ratón ampliamente utilizado para estudiar el síndrome de X frágil y se considera un mejor modelo que los supuestos imitadores de la expansión de repetición CGG15,16. Analizamos los efectos de la falta de Fmrp en la ingesta de alimentos y específicamente en una población de neuronas hipotalámicas que regulan la alimentación, la saciedad y el gasto energético.

Las mutaciones en FMR1 se asocian con un aumento de la obesidad, especialmente en los niños. El 34% de los pacientes pediátricos con FXS experimentan obesidad en comparación con el 18% de los niños no afectados3,4,5,6. La obesidad, especialmente en la infancia, conduce a un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares, síndrome metabólico, demencia y accidentes cerebrovasculares. Las causas del aumento de la obesidad en el FXS no están claras. La ingesta de alimentos y el gasto energético están regulados por el hipotálamo, que también controla otros procesos homeostáticos, como los ritmos circadianos, la termorregulación, la respuesta al estrés y la función reproductiva. Nuestro estudio anterior analizó el papel del gen Fmr1 en la reproducción, ya que las mujeres con la mutación FMR1 experimentan un cese temprano de la función reproductiva y los varones presentan macroorquidia17,18. Demostramos una mayor inervación de los folículos ováricos y de las neuronas GnRH en el hipotálamo que regulan la reproducción19. El hipotálamo recibe información sobre la disponibilidad de reservas de energía de la periferia para regular la ingesta de alimentos20,21. Las señales metabólicas están integradas principalmente por neuronas anorexigénicas de proopiomelanocortina (POMC) y neuropéptidos orexigénicos Y (NPY)/proteína relacionada con agutí (AgRP) ubicadas en el núcleo arqueado (ARC) del hipotálamo mediobasal22. Las neuronas AgRP en estado de saciedad reducen el tono GABA que normalmente inhibe las neuronas POMC23,24. Esta desinhibición conduce a la activación de las neuronas POMC y a la síntesis del péptido POMC. POMC se escinde en varios neuropéptidos, el más importante en hormonas estimulantes de melanocitos alfa (αMSH) que desempeñan un papel en la regulación del peso al unirse al receptor de melanocortina 4 (MC4R). La señalización a través de este receptor, ubicado en varios núcleos, incluido el núcleo paraventricular (PVN), el hipotálamo ventromedial (VMH) y el tronco encefálico, en el cerebro ayuda a mantener el equilibrio entre la ingesta de alimentos y el gasto energético25,26,27. Dado que las mutaciones del gen FMR1 están asociadas con una mayor obesidad, es fundamental examinar el papel de FMR1 en la regulación del equilibrio energético.

Las personas con FXS exhiben un procesamiento anormal de la información sensorial que conduce a hipersensibilidad a una variedad de estímulos sensoriales, lo que resulta en una amplia gama de síntomas conductuales13. Esto puede ser el resultado de una alteración en los niveles de varios receptores de neurotransmisores que resulta en una disminución del equilibrio sináptico inhibidor/excitador y una disminución de la plasticidad sináptica28. Las mutaciones del gen FMR1 pueden afectar el olfato, pero los resultados no están claros. Los ratones Fmr1 KO tienen una capacidad reducida para detectar el olfato, pero no hay diferencias con los controles para distinguir entre diferentes olores29. El olfato en los animales es fundamental para la detección y la ingesta de alimentos, y el bulbo olfatorio se proyecta al hipotálamo y al circuito alimentario para estimular el hambre y la ingesta de alimentos30,31. Sin embargo, no están claros los mecanismos y vías exactos que conectan las regiones olfativas del cerebro con el hipotálamo para estimular el hambre, o con las regiones que regulan la locomoción para aumentar la búsqueda de alimentos. En este estudio analizamos la alimentación y el gasto energético en ratones Fmr1 KO, y las neuronas hipotalámicas que regulan estos procesos. Determinamos que los ratones KO machos son más pesados ​​que los controles, pero carecen de diferencias en la ingesta de alimentos, mientras que la locomoción se vio afectada. Identificamos efectos profundos sobre el olfato y las neuronas POMC que regulan el gasto de energía. Por lo tanto, el olfato y las alteraciones en la actividad de las neuronas POMC probablemente contribuyan a la desregulación del equilibrio energético y al aumento de la obesidad en personas afectadas con mutaciones FMR1.

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de California (Riverside, CA) y de acuerdo con las Directrices de Uso y Cuidado de Animales de los Institutos Nacionales de Salud. El estudio se realizó y los resultados se informaron de acuerdo con las pautas de ARRIVE. Las parejas reproductoras de ratones FVB.129P2-Fmr1tm1Cgr/J (Fmr1 KO) y sus controles congénicos (WT) se obtuvieron de Jackson Laboratories y se criaron internamente. Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad y recibieron alimento y agua ad libitum. Los ratones Fmr1 KO tienen camadas más grandes19 y para evitar la influencia del tamaño de la camada en el peso de las crías, el tamaño de las camadas se normalizó a 8 ratones por camada. Estudios anteriores que utilizaron modelos de ratones FXS demostraron que estos ratones tienen una mayor respuesta al estrés y niveles alterados de glucocorticoides32. Para reducir el estrés, los animales se aclimataron mediante manipulación diaria.

Se alojaron individualmente ratones WT y Fmr1 KO de entre 8 y 10 semanas de edad en cámaras de alimentación Phenomaster (TSE Systems, Chesterfield, MO, EE. UU.) para analizar la ingesta de alimentos y la locomoción, y recibieron acceso a comida estándar y agua ad libitum durante las pruebas de comportamiento. Estas cámaras permiten un seguimiento continuo de la ingesta de alimentos y agua, y un análisis riguroso de la actividad locomotora, dado que las estructuras están equipadas con una rejilla de rayos luminosos y sensores infrarrojos en tres dimensiones. A los animales se les permitió aclimatarse durante 72 h, después de lo cual se registró la ingesta de alimento, la ingesta de agua y la locomoción. El peso de los alimentos, el agua y la actividad locomotora continua se midieron en tiempo real y se registraron utilizando el software TSE Phenomaster.

Las pruebas de alimentos enterrados y no enterrados se realizaron como se describió anteriormente33,34. Se utilizaron ratones machos y hembras, de 8 a 12 semanas de edad, después de un período de ayuno de 24 h, para localizar pellets de comida estándar enterrados o no enterrados, a partir de las 7 pm, al inicio de su ciclo activo y período de oscuridad en nuestra colonia. Para las pruebas se utilizaron jaulas de policarbonato con material de cama limpio a una profundidad de 5 cm. Se colocó un solo ratón en el centro de una jaula de prueba y se le permitió aclimatarse durante 5 minutos. Después de la aclimatación, se colocó el ratón en una jaula de almacenamiento limpia, se enterró el sedimento y se volvió a colocar el ratón en la jaula de prueba y se le permitió recuperar el sedimento de alimento enterrado dentro de un tiempo de prueba de 10 minutos. Se utilizaron jaulas de prueba y de sujeción separadas para cada ratón. Se registró la latencia, definida como el tiempo entre la colocación del ratón en la jaula y el momento en que el ratón agarra la bolita de comida con sus patas delanteras. La latencia de los animales que no recuperaron el alimento dentro de los 10 minutos se registró como 600 s. Una semana después de realizar la prueba de comida enterrada, los ratones se sometieron a la prueba de comida no enterrada. Las condiciones de aclimatación y prueba fueron idénticas a las de la prueba de comida enterrada, excepto que se cronometró a los ratones para agarrar la bolita de comida que quedó en la parte superior de la cama.

La prueba de enterramiento de mármol se realizó como se describió anteriormente35. Brevemente, se probaron ratones machos y hembras, de 8 a 12 semanas de edad, a las 7 pm, como se describe anteriormente. Se llenaron jaulas de policarbonato con tapas de filtro ajustadas con ropa de cama fresca sin perfume para ratones hasta una profundidad de 5 cm. Las canicas de vidrio estándar se lavaron con un detergente suave de laboratorio, se enjuagaron con agua destilada desionizada y se secaron, y luego se espaciaron uniformemente en cinco filas de cuatro canicas sobre la ropa de cama. La grabación de la prueba comenzó inmediatamente después de colocar al animal en la jaula, lo más lejos posible de las canicas. Se dejó que los animales exploraran tranquilamente durante 30 minutos. Los mármoles se contaron y calificaron como enterrados si dos tercios de su superficie estaban cubiertos por ropa de cama.

Los controles WT y los ratones Fmr1 KO se anestesiaron, se perfundieron con 20 ml de PBS y 20 ml de paraformaldehído al 4%; y se recogieron tejidos. Los hipotálamos se seccionaron en secciones coronales de 50 μm. Las secciones que contienen el núcleo paraventricular (PVN) y el núcleo arqueado (ARC) donde se encuentran las neuronas MC4R o POMC, respectivamente, se bloquearon y tiñeron para detectar β-endorfina para la detección de neuronas POMC (dilución 1:10.000, anti-β-endorfina de conejo, Phoenix Pharmaceuticals H-022-33), MC4R (dilución 1:1000, anti-MC4R de conejo, Abcam ab24233), subunidad del receptor GABAγ2 (dilución 1:10 000, anti-GABAγ2 de cobaya, Synaptic Systems 224 004), VGAT (1:5000, anti-VGAT de ratón, sistemas Synaptic 131 011) o cFOS (1:10.000, anti-cFOS de conejillo de indias, sistemas Synaptic 226 308) durante 48 h a 4 °C. Después de los lavados con PBST, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos secundarios: IgG anti-conejo de cabra-Alexa Fluor 488 (1:5000, Invitrogen, A11034); IgG anti-ratón-Alexa Fluor 594 (1:1000, A11032, Invitrogen); biotina anti-cobaya (1:1000, BA-7000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) seguida de estreptavidina-Cy5 (1:1000, 434316, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se realizaron controles secundarios solo de anticuerpos para determinar la especificidad de los anticuerpos. Las neuronas MC4R en el PVN se cuantificaron mediante intensidad fluorescente media (MFI) utilizando Fiji ImageJ. El número de neuronas POMC se cuantificó contando los cuerpos celulares teñidos con β-endorfina/POMC en las secciones coronales de todo el núcleo arqueado del hipotálamo. Para cuantificar el número de neuronas POMC que expresan cFOS, se tiñeron secciones coronales de 50 μm del núcleo arqueado para POMC y cFOS, y los resultados se representaron como un porcentaje de neuronas POMC positivas para cFOS. Los recuentos fueron registrados por un investigador ciego al grupo, lo que se reveló después de que se obtuvieron los recuentos. Se tomaron imágenes de todas las secciones con un microscopio Leica (DM6000) y se analizaron con Fiji ImageJ.

La inmunotinción para FMRP se realizó utilizando secciones flotantes de 50 μm que abarcan PVN (para MC4R-FMRP) o ARC (POMC/β-endorfina-FMRP). Las secciones se tiñeron durante 48 h con anti-FMRP de ratón (1:1000; Developmental Studies Hybridoma Bank, catálogo n.° 2F5-1-s, RRID: AB_10805421) y anticuerpos POMC o MC4R como se indicó anteriormente. Después de los lavados con PBST, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos secundarios: IgG anti-conejo de cabra-Alexa Fluor 488 (1:5000, Invitrogen, A11034); biotina anti-ratón (1:1000, BA-9200, Vector Laboratories, Burlingame, CA) seguida de estreptavidina-Cy5 (1:1000, 434316, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las rodajas se montaron en portaobjetos con medio de montaje Vectashield que contenía DAPI (Vector Laboratories, H-1200).

Para determinar la densidad de los puntos, seguimos nuestro protocolo establecido publicado anteriormente19,36,37. Los puntos se contaron en las neuronas individuales utilizando pilas z adquiridas con un microscopio confocal Leica SP2. Las imágenes fueron codificadas para análisis ciego. Se contaron al menos entre 15 y 20 neuronas individuales de tres grupos diferentes de ratones. La reconstrucción 3D se realizó mediante el software Imaris (Bitplane, Inc; Concord, MA).

Se obtuvieron lisados ​​​​de células completas de los hipotálamos disecados de controles WT y ratones knockout para FMR1 y, después de la determinación de proteínas, se resolvió la misma cantidad de proteína de cada muestra en SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se sondeó para detectar: ​​subunidad del receptor GABAγ2 (1: 1000, 14104-1-AP, Proteintech), VGAT (1:1000, 131 011, Synaptic Systems), MC4R (1:1000, ab24233, Abcam) o β-tubulina (1:1000, sc-9104, Santa Cruz Biotechnology ) (Información suplementaria). Las bandas se cuantificaron utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA).

Las diferencias estadísticas entre los ratones control WT y Fmr1 KO (p <0,05) se determinaron mediante la prueba t o ANOVA cuando correspondiera, seguida de la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples utilizando el software Prism (GraphPad, CA).

Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de California (Riverside, CA) y de acuerdo con las Directrices de Uso y Cuidado de Animales de los Institutos Nacionales de Salud.

Los niños y adolescentes con FXS tienen más peso que los controles de la misma edad, pero no está claro si esto se debe a la preferencia alimentaria o a los efectos de la mutación del gen FMR1 en el circuito de alimentación hipotalámico. Para abordar esta pregunta, monitoreamos el peso de los ratones Fmr1 KO y los comparamos con los controles WT. Dado que los ratones Fmr1 KO tienen camadas más grandes19, controlamos el número de crías por camada el día del nacimiento, ya que el tamaño de la camada afecta la ingesta temprana de alimentos y, en consecuencia, el peso. Normalizamos el tamaño de las camadas a 8 cachorros por camada y se analizaron 4 camadas diferentes. Monitorizamos el peso de las crías desde el día 7 posnatal (p7), cuando podemos distinguir machos y hembras, hasta p90; y determinó que los ratones macho Fmr1 KO eran más pesados ​​que los controles WT (Fig. 1a, arriba). Los ratones hembra homocigotos Fmr1 KO no mostraron diferencias en el peso (Fig. 1a, abajo), lo que coincide con las observaciones de que las hembras homocigotas FXS tienen resultados menos graves que los machos38,39,40,41. Determinamos que a partir de p10, los ratones macho Fmr1 KO eran más pesados ​​(p11 WT = 6,82 g, KO = 7,67 g, p = 0,012). La diferencia de peso se perdió durante 10 días después del destete, de p21-p30, probablemente debido al aumento de la ansiedad de los ratones Fmr1 KO después de la separación de sus madres, como se ha demostrado41,42. En p35 y después, hasta p90, los ratones macho Fmr1 KO volvieron a ser significativamente más pesados ​​que los ratones WT (p42, por ejemplo, WT = 22,9 g, KO = 25,8 g, p = 0,00023). Luego investigamos si el aumento de peso se debe a una mayor ingesta de alimentos y alojamos individualmente a ratones WT y KO en cámaras de alimentación de dos tolvas. Después de un período de aclimatación de tres días, se midieron en tiempo real la ingesta de alimentos y el consumo de agua, y la actividad locomotora durante otros 3 días. Los animales recibieron acceso ad libitum a comida y agua estándar durante las pruebas. No hubo diferencias en la ingesta de alimentos o agua, en ratones KO machos o hembras en comparación con los controles (Fig. 1b. izquierda). Para determinar si existen diferencias en los niveles de glucosa en sangre, medimos la glucosa circulante en p42, al azar y después de un ayuno de 12 h, pero no detectamos ninguna diferencia ni en hombres ni en mujeres (Fig. 1b, derecha). Usando cámaras Phenomaster para monitorear la actividad locomotora, determinamos que hubo una disminución en el movimiento de los ratones macho Fmr1 KO en comparación con WT (Fig. 1c). Esta disminución fue significativa durante el ciclo de oscuridad, lo que concuerda con informes anteriores43. Los controles WT mostraron una mayor locomoción al inicio de la fase oscura, cuando los ratones normalmente experimentan su período activo e inician la búsqueda de alimentos. Los machos Fmr1 KO exhibieron un menor aumento en esta actividad locomotora circadiana. Se calculó el área bajo la curva (AUC) para demostrar una locomoción general significativamente reducida de los ratones macho, WT = 4330 en comparación con KO = 3223 (p = 0,015; Fig. 1c, derecha). Las mujeres no mostraron una diferencia significativa en la locomoción y, de hecho, las mujeres KO mostraron una tendencia a moverse más, lo que puede corresponder a hiperactividad44. El AUC para ratones hembra fue WT = 3234 en comparación con KO = 3949 (Fig. 1d, derecha). Por lo tanto, los machos Fmr1 KO exhiben un aumento de peso, ninguna diferencia en la ingesta de alimentos y una actividad locomotora reducida en comparación con los controles, lo que probablemente contribuye al aumento de peso45.

Los ratones macho knockout (KO) para Fmr1 son más pesados ​​que los controles. (a) Los tamaños de camada se normalizaron a 8 ratones por camada, el peso de 4 camadas por genotipo monitoreado desde p7-p90 y ratones Fmr1 KO en comparación con controles FVB (WT) de tipo salvaje (KO, rojo; controles WT, negro; machos , arriba; mujeres, abajo). n = 12–16 ratones, los puntos representan la media del grupo ± error estándar. La significancia estadística entre el peso en cada edad se representa con * (p < 0,05, ANOVA seguido de la prueba post hoc de Tukey). (b) La ingesta de alimentos (izquierda) y agua (derecha) no fue diferente (acumulada, n = 8 por genotipo); Los niveles de glucosa (aleatorios, izquierda; medidos después de ayunar durante la noche, derecha) no fueron diferentes (WT, las barras negras representan la media del grupo ± error estándar, cada círculo negro representa un animal; KO, las barras rojas representan la media del grupo ± error estándar, cada cuadrado rojo representa un animal). (c) Actividad de locomoción de ratones macho medida continuamente con Phenomaster durante 48 h. A la izquierda, el eje x indica la hora del día, cuando el monitoreo comenzó a las 14:00 o 2:00 p. m., el área sombreada representa el ciclo de oscuridad, las luces en nuestro vivero se apagan de 7:00 p. m. a 7 a. m.; línea negra, peso; línea roja, Fmr1 KO; n = 8 ratones, los puntos representan la media del grupo ± error estándar; PESO, negro; KO, rojo. Derecha, área bajo la curva (AUC), WT, las barras negras representan la media del grupo ± error estándar, cada círculo negro representa un animal; KO, las barras rojas representan la media del grupo ± error estándar, cada cuadrado rojo representa un animal. (d) Actividad de locomoción, ratones hembra. La significación estadística (*, p < 0,05) se determinó con la prueba t seguida de la prueba post hoc de Tukey.

Dado que los ratones aumentan la locomoción al comienzo de su período activo, para alcanzar los gránulos de comida y comer, investigamos si los ratones Fmr1 KO exhiben una locomoción disminuida debido a la incapacidad de oler la comida. La prueba de comida enterrada mide la latencia para descubrir un pequeño trozo de comida y es un método confiable para evaluar el olfato, ya que utiliza la propensión natural de los animales a utilizar señales olfativas cuando buscan comida46. Determinamos que los ratones macho Fmr1 KO mostraron un retraso significativo en alcanzar el alimento. Los machos WT descubrieron la bolita de comida a los 136,5 s, mientras que los KO alcanzaron la bolita a los 458,8 s (Fig. 2a, p = 0,0263). No hubo diferencias en la latencia de las hembras para alcanzar la bolita de comida enterrada, lo que puede ser consistente con la falta de diferencias en la locomoción.

La prueba de comida enterrada demuestra deterioro olfativo en ratones macho Fmr1 KO. (a) Izquierda, los ratones macho WT alcanzaron el alimento enterrado más rápido que los ratones KO (p = 0,0263; WT, las barras negras representan la media del grupo ± error estándar, cada círculo negro representa un animal; KO, las barras rojas representan la media del grupo ± error estándar, cada cuadrado rojo representa un animal). Correcto, no hay diferencias en la latencia para descubrir gránulos de comida enterrados en ratones hembra. (b) No hay diferencias en la latencia para recuperar gránulos de comida no enterrados entre ratones KO y WT (izquierda, macho; derecha, hembra). (c) Izquierda, los machos WT enterraron menos canicas que los ratones macho KO (p = 0,0135). Derecha, las mujeres WT enterraron menos canicas que las mujeres KO (p = 0,0004). La significancia estadística, indicada con *, se determinó con la prueba t seguida de la prueba post hoc de Tukey.

Como control para evaluar la motivación para comer, realizamos una prueba de comida no enterrada, donde se dejó la bolita de comida en la parte superior de la cama, después de lo cual se introdujo al ratón en la jaula en la esquina opuesta. No hubo diferencias en la latencia para alcanzar el sedimento y comenzar a comer entre ratones KO y WT cuando la comida es visible, en ratones machos o hembras (Fig. 2b). Llegamos a la conclusión de que los ratones KO experimentan señales de hambre, lo que coincide con los análisis de ingesta de alimentos informados en la Fig. 1b. Dado que los ratones KO mostraron un retraso en la excavación en busca de alimento, quisimos determinar si los ratones KO Fmr1 tienen aversión a cavar y realizamos una prueba de enterramiento de mármol35. Aunque las mutaciones en FMR1 están asociadas con trastornos del espectro autista, que se caracterizan por conductas repetitivas o compulsivas, consideramos que la prueba de enterrar canicas era adecuada para controlar la disposición a cavar, ya que se trata de conductas naturales y espontáneas en ratones. Determinamos que los ratones machos y hembras Fmr1 KO enterraron significativamente más canicas (Fig. 2c). Los ratones macho WT enterraron 7,5 canicas de 20 durante el período de prueba de 30 minutos, mientras que los ratones macho KO enterraron 15,8 canicas (Fig. 2c, izquierda; p = 0,0135). Las hembras WT enterraron 10,8 canicas, en comparación con las hembras KO que enterraron 16,2 canicas (Fig. 2c, derecha; p = 0,0004). Estos resultados demuestran que los ratones Fmr1 KO exhiben un aumento de comportamientos repetitivos consistentes con modelos de autismo. Significativamente para nuestros estudios, los ratones macho Fmr1 KO tienen afinidad por cavar y, por lo tanto, el retraso en la obtención de una bolita de alimento se debe a un olfato reducido.

Para responder si el deterioro olfativo en los machos regula la locomoción a través de los circuitos de alimentación en el hipotálamo, examinamos las neuronas POMC en ratones macho, ya que las neuronas POMC regulan el gasto de energía47,48, y la ablación de las neuronas POMC reduce la locomoción en la fase oscura21. Las neuronas POMC regulan el gasto energético dirigiéndose a las neuronas MC4R, principalmente en el núcleo paraventricular (PVN) del hipotálamo49. Las neuronas POMC también se dirigen a las neuronas que expresan MC4R en la red premotora, que estimulan la locomoción50. Determinamos que el 84% de las neuronas POMC expresaban FMRP, mientras que solo el 9% de las neuronas MC4R que expresaban en el PVN contenían FMRP (Fig. 3). Por lo tanto, nos concentramos en las neuronas POMC y examinamos su inervación.

Las neuronas POMC expresan FMRP. Arriba, neuronas POMC en el núcleo arqueado teñidas con anti-β-endorfina (rojo) y anti-FMRP (verde). Imágenes representativas con objetivo ×20 (3 V, tercer ventrículo, izquierda); y objetivo ×63 (derecha). Abajo, neuronas MC4R en el PVN teñidas con anti-MC4R (rojo) y FMRP (verde). Se incluyó DAPI para detectar los núcleos (canales separados en el lateral), pero se omitió en la superposición para visualizar mejor la colocalización de FMRP con las neuronas de interés.

Luego analizamos los niveles de proteína MC4R, como objetivos de las neuronas POMC a través de αMSH, y determinamos que los niveles de MC4R son los mismos en los hipotálamos WT y KO, mediante transferencia Western (Fig. 4). La activación de las neuronas POMC se produce mediante su desinhibición mediante una inervación GABA reducida. Por lo tanto, examinamos los niveles de receptores GABAA y VGAT en el hipotálamo de Fmr1 KO en comparación con WT. GABARγ2 es la subunidad obligatoria del receptor pentamericano GABAA51, mientras que el transportador vesicular GABA (VGAT), es un marcador presináptico de las terminales GABAérgicas52,53. Hubo un aumento significativo en los niveles de proteína GABARγ2 en el hipotálamo de ratones macho Fmr1 KO, de acuerdo con nuestras observaciones previas en ratones hembra19. Sin embargo, los niveles de VGAT no fueron diferentes (Fig. 4).

Las transferencias Western de lisados ​​​​de células completas del hipotálamo determinaron cambios en las proteínas sinápticas en ratones macho Fmr1 KO. Se diseccionaron los hipotálamos y se analizaron los niveles de proteínas mediante transferencia Western. Se cuantificaron los niveles de proteína de 4 a 8 ratones por grupo utilizando ChemiDoc y la cantidad de proteína de interés se normalizó a la cantidad de β-tubulina. Cada punto representa un animal, mientras que las barras representan medias de grupo ± error estándar. La significación estadística, indicada con un * (p < 0,05), se determinó con la prueba t seguida de la prueba post hoc de Tukey.

A continuación analizamos la inervación GABAérgica de las neuronas POMC. Primero, contamos la cantidad de receptores GABAA en los somas de las neuronas POMC y determinamos un aumento significativo en ratones Fmr1 KO al 154% con respecto a WT (Fig. 5a). Para determinar el número de receptores GABAA sinápticos realizamos tinción triple para VGAT, GABAA y POMC, ya que VGAT se encuentra en la terminal presináptica GABAérgica. Teñimos la β-endorfina para detectar neuronas POMC, GABAγ2 y VGAT y contamos el número de puntos donde se encontraba VGAT en estrecha oposición a GABAγ2 en las neuronas POMC. Se contaron al menos 15 neuronas por ratón, 3 ratones por grupo (Fig. 5b). Determinamos un aumento de más de cuatro veces (hasta 409%) en la inervación GABAérgica de las neuronas POMC en ratones Fmr1 KO.

Los machos Fmr1 KO tienen una inervación GABAérgica aumentada. (a) Se cuantificaron los receptores GABAA en el soma de la neurona POMC; (b) los receptores sinápticos GABAA se cuantificaron como aposiciones de GABAγ2 y VGAT en neuronas POMC. GABAA (rojo), VGAT (verde), POMC (gris). Se cuantificaron al menos 20 neuronas por ratón y el promedio de cada ratón se representó con un punto, mientras que las barras presentan el promedio del genotipo. Abajo, reconstrucción 3D de imágenes confocales utilizando Imaris. La significación estadística, indicada con un * (p < 0,05), se determinó con la prueba t seguida de la prueba post hoc de Tukey.

Para determinar la importancia funcional de los cambios en la inervación, contamos el número de neuronas MC4R en las neuronas PVN y POMC en todo ARC en ratones Fmr1 KO y WT (Fig. 6). Determinamos que no hubo cambios en la cantidad de neuronas MC4R en el PVN (Fig. 6a). Luego evaluamos la actividad de las neuronas POMC mediante tinción para cFOS y contando el porcentaje de neuronas POMC positivas para cFOS (Fig. 6b). cFOS se encuentra en el núcleo (magenta), mientras que la β-endorfina es citoplasmática (verde). Los ratones Fmr1 KO tenían una fracción significativamente menor de neuronas POMC positivas para cFOS del 16,3% que los ratones WT, 25,2% (Fig. 6b, p = 0,006; las puntas de flecha indican neuronas positivas para cFOS; recuadro, mayor aumento de estas neuronas positivas indicadas por flechas) . Los ratones Fmr1 KO también tenían un 15,2% menos de neuronas POMC en el núcleo arqueado del hipotálamo (Fig. 6c, p = 0,04). Dada la heterogeneidad funcional y regional de las neuronas POMC, contamos las neuronas POMC por separado en la región rostral del núcleo arqueado y en la región caudal. Determinamos que la región rostral tenía específicamente un 24% menos de neuronas POMC en Fmr1 KO que los controles WT, mientras que la región caudal carecía de una diferencia significativa (Fig. 6d, p = 0,016). Dado que las neuronas POMC regulan la locomoción mediante la activación por αMSH de las neuronas MC4R en el área premotora54,55, postulamos que esta disminución en el número de neuronas POMC provoca una disminución del gasto energético debido a una menor inervación del área premotora, lo que conduce a un aumento de peso.

Disminución de la actividad y el número de neuronas POMC en el núcleo arqueado del hipotálamo en ratones macho Fmr1 KO. (a) No hay diferencias en el número de neuronas MC4R en el PVN entre ratones machos WT y KO, cuantificados como MFI usando ImageJ; Se promediaron las MFI de 5 a 7 secciones coronales por ratón; cada punto representa un animal, la barra representa la media del grupo ± SEM. (b) Los machos KO tienen menos neuronas POMC activas en comparación con los WT, determinado mediante tinción conjunta de POMC (verde, citoplasmático) y cFOS (magenta, nuclear). Las neuronas POMC positivas para cFOS se indican con puntas de flecha; los insertos contienen un mayor aumento de neuronas doblemente positivas. Derecha, números de POMC positivos para cFOS, mostrados como porcentaje. (c) los machos KO tienen menos neuronas POMC, lo que se determina contando los cuerpos celulares de β-endorfina/POMC en todo el núcleo arqueado en al menos 6 secciones por ratón y se promedia; cada punto representa un animal, la barra representa la media del grupo ± SEM. (d) Los recuentos de las regiones rostral y caudal se demostraron por separado para indicar heterogeneidad regional. La significación estadística, indicada con un * (p < 0,05), se determinó con la prueba t seguida de la prueba post hoc de Tukey.

Intentamos descubrir los efectos de la pérdida de FMRP sobre las neuronas hipotalámicas y el gasto energético, lo que puede ayudar a dilucidar los mecanismos del aumento de peso en personas afectadas por FXS debido a una mutación en el gen FMR1. Además, nuestros estudios descubrieron un factor importante, el gen FMR1, en la homeostasis del peso y la regulación de los circuitos alimentarios. Nuestros estudios determinaron un aumento de peso sin aumento de la ingesta de alimentos en ratones Fmr1 KO. Además, determinamos que el aumento de peso, específicamente en ratones macho, puede deberse a una menor locomoción durante el ciclo de oscuridad, lo que a su vez puede deberse a una alteración del olfato y a la incapacidad de oler la comida. Estos resultados apuntan al papel fundamental del FMRP en el eje del circuito de alimentación olfativa. Además, determinamos que las neuronas POMC que regulan el gasto energético reciben una mayor inervación GABAérgica y exhiben una menor actividad y un menor número en ratones Fmr1 KO. Por lo tanto, postulamos que las neuronas POMC son el eje entre el olfato, las señales de hambre y la locomoción cuando se busca comida.

Nuestros resultados pueden explicar las razones de la mayor prevalencia de obesidad en personas afectadas con FXS. El aumento de peso corporal de los ratones Fmr1 KO hasta el 115% de los controles es similar a lo observado en ratones con una deleción del receptor de leptina específicamente en las neuronas POMC, que experimentaron un aumento de peso del 120% en comparación con los controles56. El aumento en el peso corporal en ratones Fmr1 KO con fondo FVB que observamos aquí es consistente con un aumento en el peso corporal de ratones Fmr1 KO con fondo C57 informado anteriormente57. El informe de Leboucher, et al., postuló que el aumento de peso corporal se debe a los cambios en la composición corporal, concretamente a un aumento de la masa muscular y del volumen óseo, al tiempo que aporta posibilidades adicionales, como la disminución de la locomoción o la disfunción de las neuronas POMC que pueden contribuir al aumento de peso. Un estudio anterior realizado por el mismo grupo analizó indicadores metabólicos en ratones Fmr1 KO58 y encontró una falta de diferencias en los niveles de glucosa, lo que concuerda con nuestro estudio, pero informó diferencias en el perfil de lípidos séricos, leptina e insulina. Nuestro estudio puede estar de acuerdo con un estudio que utilizó un modelo de pez cebra de deleción de Fmr1, que determinó defectos de desarrollo en la corteza motora, que pueden conducir a cambios en la locomoción59. También de acuerdo con nuestros resultados aquí, se informó anteriormente una disminución de la locomoción en los ratones Fmr1 KO en el fondo C57, en un informe que demostró que la reducción del movimiento se debe a una reducción de la locomoción hacia adelante y al inicio de los combates43. Este estudio tampoco encontró diferencias en la ingesta de alimentos similares a nuestros resultados, pero a diferencia de nuestro estudio y de los estudios de Lebousher, et al., tampoco encontró diferencias en el peso o la composición corporal. Otro estudio que utilizó ratones un poco mayores, no detectó diferencias en el peso60, puede deberse a diferencias en la edad. Alternativamente, dado que los ratones Fmr1 KO tienen camadas más grandes19, normalizamos el tamaño de la camada, lo que puede explicar diferentes resultados con respecto al peso corporal.

Detectamos un aumento en los niveles del receptor GABAA en el hipotálamo de ratones Fmr1 KO. Varios estudios determinaron una disminución de varias subunidades del receptor GABAA, en la corteza y el hipocampo de ratones KO, implicando una disminución de la señalización inhibidora en la neuropatología de la enfermedad61,62,63,64. De hecho, los ratones Fmr1 KO muestran una hiperexcitabilidad cortical similar a la de los individuos con FXS65,66. Sin embargo, estas diferencias en los niveles del receptor GABAA eran específicas de una región del cerebro y no se observaron en el cerebelo64,67. Mostramos niveles elevados del receptor GABAA en el hipotálamo de ratones Fmr1 KO, lo que indica diferencias regionales adicionales. GABA es el neurotransmisor dominante en el hipotálamo68 y las neuronas GABAérgicas son neuronas de primer orden que reciben información de la periferia69, lo que indica la importancia de los circuitos inhibidores en el hipotálamo. Basándose en los hallazgos de niveles reducidos del receptor GABAA en varias áreas del cerebro, se propusieron agonistas del receptor GABAA como posibles tratamientos farmacológicos para los síntomas del FXS70,71,72. Dados nuestros resultados, este enfoque farmacológico puede aumentar la incidencia de obesidad en personas afectadas por FXS. Es de destacar que los agonistas del receptor GABAA provocan aumento de peso y disminución de la actividad locomotora cuando se administran a ratas73.

Detectamos menor actividad y menos neuronas POMC en ratones Fmr1 KO. Las neuronas POMC regulan la locomoción y el gasto energético. Se produce un aumento en el gasto de energía mediante la unión de αMSH a los receptores MC4R21. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las neuronas POMC regulan la locomoción son menos claros. Los animales aumentan la locomoción para localizar alimentos y las neuronas POMC pueden estar involucradas en este comportamiento anticipatorio48. Las neuronas POMC inervan directamente regiones de la médula espinal de las redes premotoras a través de proyecciones de largo alcance a las interneuronas V2a que expresan MC4R50. Además, la expresión de leptina a través del receptor de leptina exclusivamente en neuronas POMC de ratones KO con receptor de leptina es suficiente para estimular la locomoción74. Las neuronas AgRP también pueden estar involucradas, ya que la activación aguda de las neuronas AgRP mediada por DREADD disminuyó la actividad locomotora durante el ciclo de oscuridad75. Debido a la incapacidad de examinar las neuronas AgRP en ratones Fmr1 KO, sin cruzar a una cepa informadora de AgRP, examinamos las neuronas POMC, ya que las neuronas AgRP regulan la alimentación y la saciedad, en parte, a través de la inervación GABAérgica de las neuronas POMC23,24. Determinamos una disminución en la actividad y el número de neuronas POMC, lo que puede contribuir a una disminución de la locomoción.

Las neuronas POMC son una población heterogénea47,48. Además de la población del núcleo arqueado del hipotálamo con unas 5.000 neuronas, existe una pequeña población de unas 200 neuronas POMC en el núcleo del tracto solitario (NTS), cuya función no está clara. La ablación de las neuronas POMC en el ARC, pero no del NTS, mediada por la toxina diftérica, aumentó la ingesta de alimentos, redujo el gasto energético y disminuyó la actividad locomotora en la etapa de oscuridad21. Por ese motivo, nos centramos en las neuronas POMC del núcleo arqueado. Sin embargo, existe una mayor heterogeneidad funcional y regional dentro de las neuronas POMC hipotalámicas. Al abordar la heterogeneidad regional, las neuronas POMC del núcleo arqueado rostral se proyectan principalmente a áreas autónomas del tronco encefálico, como el complejo vagal dorsal76,77. Las neuronas POMC en la parte caudal del núcleo arqueado se proyectan hacia áreas hipotalámicas, incluido el PVH. Debido a esta heterogeneidad regional, contamos las neuronas POMC en las porciones rostral y caudal del núcleo arqueado, por separado, y detectamos una disminución en la población de POMC rostral. Los hallazgos de que las neuronas POMC de la parte rostral del núcleo arqueado se proyectan al tronco del encéfalo, que controla la locomoción54,55, pueden corresponder a nuestros resultados o a una disminución de la locomoción y menos neuronas POMC rostrales en ratones macho Fmr1 KO. La heterogeneidad funcional de las neuronas POMC dentro del núcleo arqueado puede indicar subpoblaciones con diferentes funciones en la regulación del equilibrio energético, la locomoción, la ingesta de alimentos, el metabolismo de la glucosa y los niveles de lípidos48. Se necesitan más estudios para explicar si las diferencias en la conectividad, la composición de los neurotransmisores y los receptores de neuropéptidos causan la heterogeneidad funcional.

La búsqueda de alimentos se guía por señales olfativas y va acompañada de una mayor locomoción. FMR1 se expresa en todas las regiones del cerebro asociadas con el olfato78. Los ratones Fmr1 KO exhiben disfunciones olfativas y una menor capacidad para detectar un olor, pero carecen de diferencias en la capacidad de habituarse a los olores o de discriminar entre ellos29. Un estudio en moscas determinó que se requiere la expresión de FMRP para procesar información olfativa y crear recuerdos dependientes del contexto79. También se han informado cambios estructurales y morfológicos en las regiones olfativas del cerebro en ratones Fmr1 KO13,78. Nuestros resultados utilizando la detección de gránulos de comida en la prueba de comida enterrada y la prueba de enterramiento de mármol identificaron un déficit olfativo. La prueba de búsqueda de comida enterrada, que prueba si los ratones privados de comida pueden encontrar la bolita de comida escondida debajo de la ropa de cama, determinó que los ratones macho KO exhiben un retraso, probablemente debido a la incapacidad de oler la comida. Los controles de motivación para comer, como la prueba de alimentos no enterrados, y de la capacidad de enterrar, como la prueba de enterrar canicas, determinaron que los ratones KO tienen la misma motivación para comer que los WT, lo que es consistente con la falta de diferencias en la ingesta de alimentos; y que los ratones KO entierran más y, por lo tanto, exhiben un mayor comportamiento repetitivo, consistente con los trastornos compulsivos asociados a Fmr1. Importante para nuestros estudios, este control determinó que los ratones KO tienen la capacidad de cavar en la ropa de cama. Aunque está claro que oler la comida aumenta el apetito, las conexiones entre los circuitos olfativos y los circuitos alimentarios no están completamente aclaradas. Varios estudios demostraron la conectividad entre las regiones olfativas del cerebro y las regiones hipotalámicas que regulan la ingesta de alimentos80. En concreto, se han descrito conexiones entre el bulbo olfatorio y el núcleo arqueado hipotalámico donde se ubican las neuronas POMC80,81,82. La detección sensorial de alimentos después de la presentación de los gránulos a ratones activó las neuronas POMC83, lo que indica que las neuronas POMC pueden estar involucradas en el comportamiento anticipatorio en la preparación para la ingesta de alimentos48.

Por lo tanto, es posible que la disfunción olfativa desregula las neuronas POMC, lo que a su vez disminuye la locomoción en forma de conducta de búsqueda de alimento. Esta disminución de la locomoción reduce el gasto energético y contribuye al aumento de peso, a pesar de la falta de diferencias en la ingesta global de alimentos.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Esta investigación fue apoyada por la subvención R01 HD091167 de NIH NICHD para DC. Agradecemos a los Dres. Nancy Lainez, Iryna Ethell y Anna Kulinich por su reflexiva discusión y apoyo técnico.

Este estudio fue apoyado por R01 HD091167 de NIH NICHD a D. Coss.

División de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de California, Riverside, Riverside, CA, 92521, EE. UU.

Rebecca E. Ruggiero-Ruff, Peter A. Villa, Sarah Abu Hijleh, Bryant Avalos, Nicholas V. DiPatrizio y Djurdjica Coss

Departamento de Biología Molecular, Celular y de Sistemas, Facultad de Ciencias Naturales y Agrícolas, Universidad de California, Riverside, Riverside, EE. UU.

Sachiko Haga-Yamanaka

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RRR realizó todos los experimentos aquí reportados y análisis de datos; PAV realizó estudios iniciales, reconstrucción de neuronas en 3D y participó en la caracterización del fenotipo; SAH realizó varios experimentos de inmunohistoquímica y ayudó en la cuantificación de puntos; BA y NVD proporcionaron asistencia e instrumentación para estudios de locomoción y ingesta de alimentos; SHY aportó su experiencia en pruebas de alimentos enterrados y no enterrados; DC concibió y dirigió el estudio y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Djurdjica Coss.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ruggiero-Ruff, RE, Villa, PA, Hijleh, SA et al. El aumento de peso corporal en ratones con mutación del gen de la ribonucleoproteína 1 mensajera X frágil (Fmr1) se asocia con disfunción hipotalámica. Informe científico 13, 12666 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39643-z

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Recibido: 15 de marzo de 2023

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39643-z

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